Chromatography Là Gì

HPLC là chữ viết tắt 4 vần âm đầu bằng tiếng Anh của cách thức sắc cam kết lỏng tính năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký kết lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

Bạn đang xem: Chromatography là gì

Bạn đã xem: Chromatography là gì

1.Khái niệmPhương pháp sắc cam kết lỏng hiệu năng cao (HPLC) thành lập và hoạt động năm 1967-1968 bên trên cơ sở cải cách và phát triển và cách tân từ cách thức sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách bóc trong đó pha hễ là hóa học lỏng với pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân loại dưới dạng tè phân hoặc một hóa học lỏng trùm lên một hóa học mang rắn, hay là 1 chất với đã được biến chuyển bằng links hóa học tập với những nhóm chức hữu cơ. Cách thức này ngày dần được sử dụng thoáng rộng và phổ cập vì những lý do: tất cả độ nhạy cảm cao, tài năng định lượng tốt, thích hợp bóc tách các hợp chất khó cất cánh hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.Phạm vi vận dụng của cách thức HPLC cực kỳ rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc phòng sinh, các chất phụ gia hoa màu trong nghành nghề thực phẩm, dược phẩm, môi trường…2.Phân loạiDựa vào sự không giống nhau về cơ chế tách bóc chiết áp dụng trong HPLC, fan ta phân chia HPLC thành 4 loại:

Sắc ký kết hấp phụ giỏi sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). Sắc đẹp ký phân bổ (partition chromatography). Sắc ký ion (ion chromatography). Sắc ký kết rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó, nhan sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều độc nhất vô nhị vì có thể phân tích được phần lớn hợp hóa học từ không phân cực đến các hợp chất rất phân cực, hợp hóa học ion có cân nặng phân tử không quá lớn (SKPB được tạo thành hai loại dựa vào độ phân cực tương đối giữa trộn tĩnh và pha động: sắc ký kết pha thường xuyên – SKPT (normal phase chromatography) với sắc cam kết pha hòn đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).Trong SKPT, trộn tĩnh áp dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Trộn tĩnh loại này sẽ có được ái lực với những hợp chất phân cực. SKPT sử dụng để tách bóc và phân tích những hợp chất bao gồm độ phân rất cao với phân tử lượng thuôn lắm.SKPĐ là thuật ngữ nhằm chỉ một một số loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn trộn động. Phương pháp này sử dụng phân tích những hợp chất từ không phân cực mang đến phân cực. Hầu hết các hợp hóa học hữu cơ gồm mạch carbon lâu năm (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là những dung môi phân cực, trong những số đó dung môi nước đóng vai trò đặc biệt quan trọng mà lại phải chăng tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và thịnh hành hơn SKPT.3. Trộn tĩnh vào sắc ký pha đảo Trong sắc ký phân bổ nói chung, pha tĩnh là số đông hợp hóa học hữu cơ được gắn thêm lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành trường đoản cú silica theo hai kiểu:

Pha tĩnh được bảo quản trên hóa học mang rắn bởi cơ chế hấp phụ đồ lý → sắc ký kết lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Trộn tĩnh link hóa học với hóa học nền → sắc ký kết pha links (bonded phase chromatography)Trong quá trình sử dụng, bạn ta nhận ra sắc cam kết pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vị một số tại sao sau: trộn tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ dẫn đến hòa tan bởi vì pha động đề nghị dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời hạn sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. Bởi pha tĩnh của sắc cam kết lỏng-lỏng dễ tan vào pha cồn nên tín đồ ta tất yêu ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

Vì vậy, tín đồ ta thường xuyên chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bổ pha link và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong nhan sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.Bề mặt những hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được giải pháp xử lý (thủy phân) bằng cách đun lạnh với HCl 0,1M vào một hoặc nhị ngày để tạo nên những team SiOH như sau (thông thường xuyên chỉ có tầm khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):


*

Sau đó mặt phẳng silica vẫn thủy phân này sẽ được cho phản bội ứng với các organochlorosilan để tạo ra các trộn tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc khôn cùng phân cực tùy thuộc vào nhóm R gắn thêm vào.


*

Thường chỉ khoảng 1/2 nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức đúng theo chất yêu cầu phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ ảnh hưởng giữ lại do những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, điểm sáng của chất tan và pha tĩnh.Trong SKPĐ, nhóm núm R vào hợp hóa học siloxan phần đông không phân cực hoặc không nhiều phân cực. Đó là các ankyl dây tương đối dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc những nhóm alkyl ngắn hơn như là C2; hình như còn tất cả cyclohexyl, phenyl trong các số đó nhóm phenyl gồm độ phân cực cao hơn nữa nhóm alkyl. Tín đồ ta nhận thấy các alkyl dây khá dài cho kết quả tách bóc ổn định hơn những loại không giống nên đây là loại được áp dụng nhiều nhất.


*

Tuy nhiên vày hiệu ứng lập thể buộc phải trong kết cấu của trộn tĩnh còn đội –OH chưa phản ứng, gây tác động xấu mang đến quá trình tách bóc sắc ký kết tùy môi trường xung quanh pH phân tích.Trong môi trường xung quanh quá acid (pH Trong môi trường thiên nhiên baz (pH > 7), bao gồm nền silic mang pha tĩnh rất có thể bị kết hợp (SiO2 thành silicat), hệ trái là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng lớn ra và thời gian lưu cũng rất có thể giảm. Công dụng phân tích như vậy sẽ thiếu tính độ thiết yếu xác.Một giữa những cách khắc phục hiện tượng lạ này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít áp dụng hơn) để liên can với đội –OH này (gọi là hiện tượng kỳ lạ end-capping). Từ bây giờ ta sẽ có loại cột ít tác động với chất phân tích gồm tính baz (cột LC-DB của hãng sản xuất SUPELCO).

Xem thêm: Báo Cắt Mạng Vnpt Như Thế Nào, Hướng Dẫn Cắt Mạng Vnpt Khi Chưa Hết Hợp Đồng


*


*

Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân rất để tăng thêm độ phân cực của dây C18, có tác dụng cột bao gồm khả năng bóc chọn thanh lọc hơn so với những hợp hóa học phân cực to gan (cột EPS – Expended Polar Selectivity).Ngoài sườn silica, thời gian cách đây không lâu người ta có áp dụng đến nền vật liệu nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) chất nhận được phân tích trong môi trường pH từ là 1 – 13. Cột này dễ áp dụng trong môi trường thiên nhiên acid với baz mạnh. 4. Pha hễ trong sắc ký pha đảo Pha động trong sắc ký kết lỏng nói chung đề xuất đạt những yêu cầu sau: Hòa tan mẫu phân tích. Tương xứng với đầu dò. Không hòa tan hay làm cho mòn pha tĩnh. Có độ nhớt thấp nhằm tránh áp suất dội lại cao. Tinh khiết sử dụng cho sắc ký kết (HPLC grade).

Trong sắc ký trộn đảo, dung môi trộn động tất cả độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng không ít dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy thêm methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) cùng tetrahydrofuran (THF) là đã đạt được yêu mong nhất. Nước là 1 trong những dung môi được cho vào những dung môi hữu cơ nhằm giảm kỹ năng rửa giải.Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số đồ vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), ánh sáng sôi (boiling point), độ phân rất (polarity index), độ cọ giải (eluent strength)…Trong kia độ phân cực và độ rửa giải có tác động ảnh hưởng lớn lên kỹ năng phân bóc tách của các mũi sắc ký.

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách bóc các mũi sắc đẹp ký: số đĩa kim chỉ nan N, hệ số dung tích K’, độ chọn lọc α . Khi sự đổi khác thành phần pha động không mang đến kết quả tách mũi theo yêu mong thì bọn họ phải rứa đổi thực chất pha cồn (sử dụng dung môi khác), tức biến hóa α. Đôi khi có thể phải biến hóa cả trộn tĩnh.Trong quá trình bóc của SKPĐ, sự liên can giữa vừa lòng chất đề nghị phân tích cùng pha động phụ thuộc rất những vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.Thông hay pha hễ trong SKPĐ gồm 1 hỗn thích hợp nước hoặc hỗn hợp đệm với 1 hoặc những dung môi hữu cơ phân rất tan được trong nước. Nước là 1 trong những dung môi rất phân cực vì thế nó không địa chỉ với số đông nhóm alkyl không phân cực trong trộn tĩnh, cho nên vì thế nó được xem như pha rượu cồn yếu nhất cùng có tốc độ rửa giải muộn nhất trong toàn bộ các dung môi động của SKPĐ.Hỗn đúng theo nước cùng dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.

Việc lựa chọn dung môi cùng thành phần dung môi trong pha động được buổi tối ưu hóa cho đa số hợp chất đề nghị phân tích. Thông thường, người ta thực hiện hỗn thích hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một các thành phần hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ sở hữu sự trộn lẫn của các dung môi cơ học với nước. Khi lựa chọn thì bắt buộc chọn các hỗn phù hợp MeOH, ACN cùng THF cùng với nước gồm độ cọ giải tương đồng.Thành phần trộn động tất cả thể cố định trong suốt quy trình chạy sắc cam kết (chế độ isocratic) hoặc được chuyển đổi theo một lịch trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả bóc tách tốt hơn.5. Một số đại lượng cơ bản trong so sánh sắc ký5.1. Hệ số phân bốCân bởi của một cấu tử X trong hệ sắc đẹp ký rất có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số thăng bằng K cho thăng bằng này được điện thoại tư vấn là tỉ lệ phân bổ hay hằng số phân bổ (partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS : nồng độ cấu tử trong trộn tĩnh.CM : nồng độ cấu tử trong trộn động.Hệ số K tùy ở trong vào bản chất pha tĩnh, pha đụng và hóa học phân tích.5.2. Thời hạn lưu:tR : thời hạn lưu của một cấu tử từ khi vào cột mang đến khi tách bóc ra ngồi cột.tO : thời gian làm cho chất nào đó không tồn tại ái lực với pha tĩnh đi qua cột; này cũng là thời hạn pha rượu cồn đi từ trên đầu cột cho cuối cột và nói một cách khác là thời gian lưu lại chết.tR" : thời hạn lưu thiệt của một cấu tử.

Với W1/2 là chiều rộng mũi dung nhan ký tại phần ½ độ cao mũi (phút)W là chiều rộng lớn mũi dung nhan ký ở chỗ đáy mũi (phút)5.5. Độ lựa chọn lọcĐặc trưng mang đến khả năng tách bóc hai chất của cột.

5.6. Độ phân giải:Đây là đại lượng biểu lộ rõ cả ba kỹ năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự tinh lọc và kết quả tách. Nó được xác minh qua phương trình sau: